[转] 【养龟知识】生态养殖法成功繁育濒危物种四眼斑水龟的研究
[转] 【养龟知识】生态养殖法成功繁育濒危物种四眼斑水龟的研究 四眼斑水龟(Sacalia quadriocellata)被国际自然保护联盟（IUCN）列为濒危物种，人类对该物种的需求日益增长，人工繁殖一直不成功，其野生资源遭到持续破坏，种群数量急剧减少，在很多区域已濒临灭绝。在龟类资源遭受严重破坏的今天，龟类养殖被世界各国同行公认为挽救濒危龟类惨遭灭绝最急迫也是最有效的方法之一。以往对四眼斑水龟的人工驯养繁殖也有过许多尝试，但均不成功。我们自2007年1月至2009年3月，在饲养条件下通过改变饲养环境、光周期、食物组成等，以生态养殖法和卵孵化条件的严格控制，在饲养条件下连续两年繁殖出两批共8只健康生长的幼体，首次成功突破了四眼斑水龟在人工养殖条件下的繁育问题，为减轻该物种野生种群的压力及人类对该物种的可持续利用提供了机会，也为其他濒危龟类的人工驯养繁殖提供了范例。关键词：四眼斑水龟；人工饲养；成功繁殖；孵化；濒危物种.四眼斑水龟(Sacalia quadriocellata)为濒危物种（IUCN，2006；赵尔宓,1998）。由于环境的严重破坏和因宠物、食物及医药需求而导致的过渡猎捕，使得四眼斑水龟野生种群数量急剧下降，在很多区域已濒临灭绝（Debruin et al., 1999; Lau & Shi, 2000; 龚世平等, 2003）。
在龟类资源遭受严重破坏的今天，龟类养殖被世界各国同行公认为挽救龟类惨遭灭绝最急迫也最有效的方法（Behler, 1997; IUCN, 1987）。许多野生濒危的龟鳖类物种已通过人工饲养繁殖成功地实现了种的保护（Schleicher and Loehr, 2001; Schleicher, 2004; Symanski, 2004; Beil, 2005; Detlef and Fritzsche, 2005）。对四眼斑水龟的人工饲养均以只能饲养而不能繁育告终，无法缓解市场对野生种群的需求，间接导致野外种群数下降（夏金叶, 1983; Rodel, 1985;宋憬愚等, 2002）。
四眼斑水龟人工的驯养繁殖的研究已有很多尝试，但均不成功（周婷, 1997；王志伟等，2005）。主要原因是该物种生性胆小，在人工饲养环境下难以满足其野生山涧溪流的独特生存环境和食性，正常的行为受到严重抑制，始终处于紧张和不适应的状态而无法正常生存和繁殖。早期的死亡率高达85%，主要是腐甲病、水肿病、肠胃病等（王志伟等，2009），没有任何繁殖行为的表现。
本课题组（龟类研究兴趣小组）从2004年到2006年曾经尝试用激素诱导的方法克服其室内繁殖障碍的难题，有效促进了繁殖行为的表现，并产下3枚卵。但遗憾的是未能孵出幼体。即便能够成功繁殖，人为注入外源激素的使用也会使繁殖个体和其后代以及利用这些龟类产品的人类产生长期的负面影响。
实际上温度、光周期、降雨量、湿度和食物供应等外界因子均可通过直接或者间接的途径影响龟类的繁殖（Duvall et al., 1982）。光照等环境因子可以直接引起生理变化和机体内在节律的表达，从而影响龟类的繁殖；人工饲养条件下频繁的人为干扰将明显胁迫龟类的正常繁殖；只有当机体摄取的营养物达到身体所需的某一临界值时其性腺才会正常发育以完成繁殖（Kuchling, 1998）。
为探究出一套适用性较强并易于付诸大规模养殖推广的技术，满足人们对该物种的大量需求及减轻野生种群的压力，实现成功繁殖且保证成功繁殖出的个体无外源激素污染的负面影响，本课题主要利用即将被烹调的自宾馆饭店抢救来的四眼斑水龟，开展了一系列生态养殖法的研究，取得显著成效。
1 材料与方法
参与实验的56只四眼斑水龟（30♀，26♂）主要自海南岛琼中地区，已在本实验室饲养多年。采用数字监控保安系统记录个体发情求偶和产卵等行为（Liu et al.,2008），运用全事件取样法和瞬时扫描取样法观察记录行为（蒋志刚，1999）。每月对雌性个体按照David et al. (1998)所描述方法进行超声波检测，记录卵泡发育情况；并以X光投射法(Gibbons et al.,1979)确定硬壳卵的数量。卵泡个数统计公式：检测到卵泡数（枚）=左右鼠蹊部检测卵泡数之和（包括闭锁卵泡）
生态养殖池的建设面积为33 m2，且池内土壤、石块、植被等均采自琼中湾岭地区四眼斑水龟典型的野生环境。
1.1 减少胁迫试验
2007年之前所有个体均混池饲养于80cm×60cm的水池中，饲养密度为10只/ m2，饲养密度过小将直接引起个体间频繁的冲突而影响雌性正常繁殖，且频繁进出饲养室、日常的喂食换水及测温度都将引起较为严重人为胁迫。针对以上问题：2007年8月至2009年5月将24只个体（12♀，12♂）饲养于室外以遮阳布处理且放置有四眼斑水龟野外生境中的石头、植被等物，面积为33m2的池子（简称“生态池”）中，严格控制进出生态池的频次，减少喂食换水和测温度的频次。
1.2 补充食物营养试验
本实验室自2002年开始至2006年12月，室内饲养四眼斑水龟以甲鱼2号饲料1:1混合自来水，同时间断的每次投喂一种肉类或植物性食物（水果和蔬菜）饲喂四眼斑水龟，发现其喜食饲料和肉类，极少摄取植物性食物，这与其野外以植物性食物为主相悖（史海涛等，2002），且导致营养单一以致将威胁其健康。为提供更加丰富的营养和合理膳食即采取以下途径：自2007年2月给予8只雌性个体采用绞碎机将32种食物（包括：胡萝卜、香菜、瘦猪肉、西葫芦、椰子菜、苦瓜、绿豆芽、白萝卜、空心菜、牛肝、黄豆、西红柿、南瓜、茄子、菜花、红薯、菠菜、生菜、鸡蛋、鱼、香菜、黄豆芽、芹菜、地瓜叶、西瓜、黄瓜、大白菜、猪肝、玉米、韭菜、小白菜、莴笋叶）绞碎成汁按照1:1配合混合饲料活成面团进行投喂以丰富和补充个体所需营养，同时根据各种食物的营养含量合理搭配（每次仅选取其中2—3种食物投喂），每次所加食物均按照等量配比后绞碎成汁与甲鱼2号饲料1:1混合。食物种类均结合王志伟（2005）对饲养条件下四眼斑水龟食性的研究结果选择四眼斑水龟喜食食物。
1.3 光照影响性腺发育试验
四眼斑水龟饲养于室内多年但池内无自然光照射，池内光强始终为零，表现为光周期不明显，从而可能引起体内褪黑素（MLT）分泌增多而抑制“下丘脑—垂体—性腺”轴的功能，使得生殖激素的分泌减少而影响正常繁殖，为进一步探究光周期等环境因子对四眼斑水龟繁殖的影响，2008年10月至2009年3月将28只四眼斑水龟（14♀，14♂）均分为两个组：长日照组（15L: 9D）、短日照组（9L:15D）均给予自然光，即在室外饲养，通过UVB灯管补光延长光周期，三夹板封盖池口遮光以缩短光周期。
产卵率计算公式：产卵率（%）=产卵个体数/实验个体数
1.4 雌雄混放试验
为获得更多的受精卵，本实验室于2006年至2009年在每年的繁殖期将实验所用雌雄个体适时地进行雌雄混放。具体操作如下：（1）2006年11月至12月仅将用于激素实验的13只雌性个体与雄性进行混放录像观察，共6次，每次混放24h；（2）2007年12月将所有雌性个体分池于雄性混放，并随机选池录像，共6次，每次混放24h；（3）2008年10月至2009年1月将8只雌性个体与5只雄性个体混放，共11次，每次混放96—120h；同时其余个体自10月即一直于雄性混养用于光照影响性腺发育试验。
1.5 孵化试验
2007年3月至7月和08年4月至8月分别对本实验室所产下的4枚和8枚受精卵进行孵化。本实验人工气候箱（德国产的KBWF240# 01-22996 型）设置温度为24—27℃（2007年控温在26—27℃，2008年控温在24—25℃），箱内相对湿度控制为90%。孵化用具为杉木箱 (37cm×30cm×20cm)和塑料盒 (34cm×22cm×11cm)，箱子和塑料盒上开有若干小孔，底部分别垫一块纱布，卵底层放置4—5cm基质，卵表面加1—2cm的基质。07年以沙土为基质；08年控温组分别用沙土和蛭石作为基质，常温组为蛭石。每天分5个时段（每隔5小时左右测量一次）记录每组温湿度，同时根据基质失水情况适当的在其表面洒水，以保持含水量。
孵化总积温计算公式：孵化总积温(·day℃)=孵化日平均温度×孵化天数
1.6 数据处理
本文数据在Excel（2003）和SPSS（16.0）中进行处理，所有实验数据均以X±S.D.表示。χ2检验两种喂食方案补充食物营养前后产卵率差异显著性；非参数Mann-Whitney U检验放入生态池前后个体产卵数、长短光周期对卵泡发育和产卵情况差异显著性。设置显著水平α=0.05，极显著水平α=0.01。
2 结果与分析
2.1 改变饲养条件对繁殖的影响
饲养于生态池中的12只雌性个体仅2只在放入生态池前产过卵，放入生态池中饲养后有7只个体产卵，对处理前后个体产卵数（未产卵个体记为0枚）经Mann-Whitney U检验知差异显著（Z=-2.003, n=24, p=0.045<0.05）。
2.2 补充食物营养对繁殖的影响
在室内单池饲养且按照改善后喂食方案饲喂之前，21只雌性个体仅5只成功产卵；自2007年2月对8只个体按照改进的饲养方法喂养后，2008年和2009年均发现8只雌性个体中有7只成功产卵，经χ2检验知处理前后产卵率差异极显著（χ2=7.240,df=1,p=0.007<0.01）。
2.3 光周期对性腺发育的影响
结合2008年9月到2009年2月的B超检测，可知：短日照组卵泡发育情况好于长日照，对每月检测到卵泡数进行Mann-Whitney U检验知两种光周期下各个月份其卵泡数差异均不显著。对经B超检测发现怀有硬壳卵个体进行X光检测发现：短日照有3只个体怀卵，共6枚；长日照仅1只个体怀卵，共2枚。经Mann-Whitney U检验知组间产卵数差异不显著（p=0.262>0.05）。
2008年11月至2009年2月的录像观察发现：长日照组雄性个体有4只个体出现明显发情行为，并有成功交配行为，行为占全天时间的0.617±0.758%（n=6）；短日照组有3只个体出现发情行为，占全天时间的0.616±0.731%（n=6）。将两组个体的发情行为进行非参数Mann-Whitney U检验，发现差异不显著（p=0.868>0.05）。
2.4雌雄混放对受精率的影响
结合试验处理后次年产卵情况可知，2007年有5只个体产卵（均来自混放的13只个体中），2只产下受精卵；2008年有10只个体产卵，4只产下受精卵；2009年有16只个体产卵，8只个体产下受精卵。
2.5孵化结果
2007年和2008年分别对4枚和8枚受精卵（图2）孵化，各成功孵出4只四眼斑水龟幼体（见图3）。控制温度在24—27℃，平均孵化期为107±11d（n=7, 93～119d），平均孵化总积温为2640.4±191.7·d℃ay（n=7，2390.1～2919.6·d℃ay）。结合两年的数据可知：常温组孵化率33.3%（3枚入孵，1枚孵出），控温组孵化率77.8%（9枚入孵，7枚孵出），经χ2检验知：不同组间孵化率表现为差异不显著（χ2=0.500,df=1,p=0.480>0.05）；其中07年控温组孵化率100%（3枚入孵，3枚孵出，平均孵化期为96±4d），08年控温组孵化率66.7%（6枚入孵，4枚孵出，平均孵化期为115±4d）。其中蛭石组孵化率20.0%（5枚入孵，1枚孵出），沙土组孵化率100%（7枚入孵，7枚孵出）。
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3讨论
3.1 减少人为胁迫对成功繁殖的作用
野生龟鳖类从野外引入室内饲养会干扰正常的生殖过程（Kuchling and Bradshaw, 1993）。饲养条件下，血浆性激素浓度下降（Kuchling, 1998）；应对饲养胁迫，龟类会提高皮质激素的浓度（Tyrrell and Cree, 1998）。大量的四眼斑水龟在饲养条件下表现出皮肤变薄，脂肪向中性移动现象显示了其糖皮质激素分泌过量。本实验所用个体，由于人为、环境和饲养密度过小等作用造成胁迫，胁迫通过HPA轴（下丘脑-垂体-肾上腺，hypothalamo-pituitary- adrenocortical），引起肾上腺分泌肾上腺皮质酮增加。糖皮质激素的分泌有利于个体克服胁迫，比如活动量增加以获取足够的食物（Berdanier, 1989; Boswell et al., 1994; Holberton et al., 1996）。这就意味着四眼斑水龟处于胁迫状态下。皮质酮的升高可能通过对性腺局部作用或通过对下丘脑—垂体轴的抑制，对性激素的合成或释放起抑制作用（Paolucci et al.,1990）。对很多爬行动物的研究显示，糖皮质激素浓度的增高限制了爬行动物睾丸功能。在蛇类（Thamnophis sirtalis）的研究中发现，注射外源糖皮质激素抑制了该物种求偶交配行为的表现（Moore and Mason, 2001）。基于以上推测，作者认为饲养条件下饲养胁迫导致雄性四眼斑水龟生殖激素分泌不足，这在激素诱导雄性能立即表达发情行为（Liu et al., 2008）得到验证。将雌性置于生态池和室内单池饲养（尽量减小饲养密度而减少干扰）后能正常成功繁殖。这些证据证实了：不适应的环境导致性腺发育不良和激素分泌量下降，最终导致繁殖障碍。
3.2 食物营养对成功繁殖的作用
通过对传统喂食方案进行分析发现：四眼斑水龟经常食用饲料及肉类食物，极少摄取植物性食物（水果和蔬菜），直接导致营养过于单一，同时打乱了其野外主要以植物性食物为主（史海涛，2002）的食性规律。改善喂食方案后，食物中的营养更加均衡，且更有利于个体吸收。Kuchling (1998) 研究表明在产卵前期和产卵期丰富的食物营养供应是大多数龟类成功繁殖的关键因子之一。营养充足供应引起相对较多的卵泡募集发育，相反，营养不充足会导致卵泡在发育过程中闭锁或者中止（Kuchling and Bradshaw, 1993）。而本实验中自2007年2月改变喂食方案后，个体摄取营养物质更加合理和丰富，从而在2008年和2009年分别有24枚和40枚硬壳卵生成，这充分体现了营养充足供应极其突出的作用。因此，丰富食物营养也有利于实现成功繁殖。
3.3 光周期对四眼斑水龟繁殖的影响
结合B超检测结果可知，短日照组对雌性卵泡发育有促进作用，长日照组相对表现出一定的抑制作用，这可能是由于四眼斑水龟属于短日照动物。对于短日照动物，在短白昼期间高浓度的褪黑素抑制促乳素释放，刺激GnRH和促性腺激素释放增加，性腺活动增强，褪黑素表现为促进繁殖的作用（朱士恩，2006）。长时间处于长光照条件下将导致光钝化而使长光照刺激GnRH和促性腺激素释放作用减弱或者停止（张录强，2000），因此长日照组出现相对的抑制作用。
相较于雌性而言，长日照对雄性的作用相对短日照要明显。两组相对比：发情行为占全天时间基本一致，但是长日照组出现明显的交配行为且发情个体多于短日照组。造成雌雄差异的原因可能是由于雄性性腺发育早于雌性（Ganzhorn D，1983），即雌雄性腺发育机制不同。傅丽容等（2007）报道雄性四眼斑水龟的精子发生期在夏秋季节，冬季为精子发生停滞期。本次录像观察到雄性发情强度均不够明显可能是因为实验期为雄性个体性腺发育的停滞期，光照作用还无法表现，其中缘由有待进一步探究。
3.4雌雄混放对成功繁殖的作用
交配刺激诱导排卵在很多哺乳动物中有所报道（Kauffman and Rissman，2006），近年来对爬行动物的研究也发现交配可以刺激诱导雌性个体成功排卵（Mendonca and Crews,1989；Mathies et al., 2004），其中Manire等（2008）对蠵龟研究也发现交配有利于排卵并保证了一定的受精率，而长时间的雌雄混养保证了交配率。研究表明当子宫颈因交配受到刺激后，通过神经系统反射性地兴奋下丘脑—垂体—卵巢轴，从而引起排卵（杨增明等，2005）。因此作者认为保证长时间的雌雄混养将有利于雌性个体体内分泌足够性激素以补充因饲养胁迫而引起的激素缺乏，从而保证更多的雌性个体正常繁殖；同时混放时间和频次的增加将大大提高交配率，直接保证受精率的提高。
3.5孵化因子对孵化率的影响
温度是动物环境中的重要因素，孵化温度直接影响卵生爬行动物的孵化率和孵化时间（Packard et al，1987）。极端高温、低温导致胚胎不能孵化或畸形率增加甚至死亡（Vinegar，1974）。本实验中常温组在孵化后期温度较高（平均温度达到30℃），控温组温度始终相对较低（24—27℃），而常温组孵化率较低即由于孵化后期温度过高而阻碍胚胎发育以致死亡，此结果与李珊（2002）对乌龟的报道一致。
卵生爬行动物卵的孵化期一般都随孵化温度的升高而缩短(Molina et al.,1998；Paez et al.,1998)，对比07年和08年控温组孵化结果可以发现四眼斑水龟也符合这一结果。然而所有爬行动物卵均具有一个相对的存活孵化温度范围（许雪峰，2003），且在此范围内卵的质量随孵化期延长而减小（计翔等，1991），结合本实验结果发现08年控温组孵化率较07年低的原因即是温度过低而延长孵化期，最终减小卵的质量而降低孵化率，因而可以初步判断四眼斑水龟最适宜的孵化温度为27—30℃。由于室内和人工气候箱内大气湿度均在85%左右，处于龟类孵化的最适湿度范围（李珊，2002），因此湿度在本实验中对孵化率的影响不大。同时究竟以沙土还是蛭石为孵化基质可能对四眼斑水龟的孵化率影响不大。
3.5 小结
实现成功繁殖的途径有：1.减少人为胁迫——增加水深，提供隐蔽场所或者饲养于室外模拟原生态池中。2. 增加食物营养——通过绞碎机将食物绞碎成汁，并与饲料1:1混合投喂。3.改变环境因子促进性腺发育——通过缩短光周期（9L:15D）促进雌性卵泡发育，延长光周期（15L:9D）促进雄性睾丸发育。同时保证雌雄在繁殖期有较长时间混养。成功孵化的方法：使用沙土为孵化基质，控制温度在27—28℃，每日定时3次分别喷洒30mL左右水于孵化箱四周及表面以保持沙土湿度和孵化环境中大气湿度为80—90%，如此操作即可保证孵化成功。
致谢
本研究得到国家自然科学基金项目(No.30260019，No.30660026)以及海南省重点科技项目（06122）资助，在史海涛教授的悉心指导下完成，海南医学院曾苹青主任给龟做B超检测，在实验设计和论文完成过程中得到海南师范大学洪美玲副教授、傅丽容副教授、汪继超老师和王力军副教授等老师提出的宝贵意见；在工作中和实验设计及论文修改中得到海南师范大学硕士研究生刘宇翔，贺斌学长的大力帮助；在日常工作中得到马永刚、何绿艳、安莹、梁茜茜和廖英等同学的热心帮助。在此一并表示最衷心的感谢!
[转] 【龟蛋】
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